Определение чувствительности к антибиотикам: методы, результаты, оценка. Новые методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам

Идея челночного бега разработана датчанином Йенгсом Бенгсбо и состоит из интенсивной интервальной физической нагрузки (интервальный тест на выносливость, ключевое слово «интенсивной») и способности восстанавливаться после её выполнения (интервальный тест восстановления, опять же после интенсивной физической нагрузки), а при снятии показаний ЧСС еще и определять индивидуальные особенности организма спортсмена в аэробном (в большей степени) и анаэробном режиме.

Йо-Йо тест:

Фишками обозначают три линии (см.фото). 5 метров для восстановления и 20 метров для бега. Тест включает в себя бег между фишек, расположенных на удалении 20 метров друг от друга, туда и обратно. Старт по команде. Время между сигналами, т.е время для прохождения 40 метрового отрезка постепенно сокращается в зависимости от уровня. Время между отдыхом и основным бегом составляет 5 или 10 секунд в зависимости от разновидности Йо-йо теста. Спортсмен начинает тест с маленького уровня, где поочередно с отдыхом проходит отрезки за определенное время. Потом наступает следующий уровень, где количество отрезков на уровне увеличивается, а время прохождения отрезка в 40 метров уменьшается и повышается скорость бега. Т.е спортсмены неоднократно, без остановки выполняют рывки с восстановлением, и с повышением уровня. Время, положенное для прохождения отрезка уменьшается. Игрок сходит с Йо-йо теста, когда он уже не будет успевать проходить отрезки за положенное время. Концом Йо-йо теста является общее расстояние, которое спортсмен пробежал до схода с дистанции.

Отлично: Скорость 19 - 20 км/ч Дистанция: > 2320 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >58
Очень хорошо: Скорость 18-19 км/ч Дистанция: >2000 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >50
Хорошо: Скорость 17-18 км/ч Дистанция: >1680 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >42
Плохо: Скорость 16-17 км/ч Дистанция: >1360 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >34
Очень плохо: Скорость 15-16 км/ч Дистанция: >1040 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >26

Идея тестирования нивелируется или, можно сказать, дискредитируется нежеланием футболистов его проходить или формальным подходом к участию в нем. Основная масса игроков проходит 40-метровые отрезки так и не выходя на максимальное значение ЧСС, а когда наступает порог, при пересечении которого необходимо прикладывать усилия, они просто сходят с дистанции. Считают, что лишний раз напрягаться не имеет смысла: «Ко мне какие претензии, я пробежал».

Особенно таким умозаключениям подвержены опытные футболисты. Поэтому 75 % результатов Йо-Йо теста после проведения в российских командах можно выбрасывать в мусорную корзину, поскольку они не несут никакой информативности, а даже наоборот сбивают с толку своими результатами и уводят тренерский состав и врачей команд не в том направлении относительно функциональной готовности игроков команды.

Курсы повышения квалификации по программе «Спортивная психология». Июнь 2019 год.

АНО ДПО "Национальный институт биомедицины и спорта"

Новый футбольный клуб ищет врача команды. Срочно.

Сезон стартует через 10 дней 770

Новости о спортивной медицине, интересные вам:

Определены ключевые факторы успеха на Чемпионате мира по регби

Проведя ряд исследований, британские спортивные врачи пришли к выводу, что залогом успеха команд по регби на Чемпионате мира с 1987 по 2007 г. являлись антропометрические показатели игроков, а именно 1535

Е-тест (Etest ) — хорошо продуманный метод для определения антибиотикочувствительности в лабораториях всего мира. Он широко применяются в изучении резистентности как в диагностических, так и в испытательных клиниках. Тест представляет собой количественный метод определения МИК противогрибковых и антибактериальных препаратов для инфекционных агентов, в том числе септических, что особенно важно для тяжелых больных. В этом методе в настоящий момент насчитывается 100 с лишним антибиотиков для тестирования ряда аэробных бактерий и привередливых организмов, таких как пневмококки, гемофильные микроорганизмы, H.pylori, менингококки, гонококки, анаэробны, грибы, и микобактерии. Е-тест дает возможность рационального использования антибиотиков, обеспечивающих наилучший результат для пациентов, а так же для коррекции схемы лечения после эмпирического назначения препаратов. Тест чрезвычайно важен для определения дозы антибиотика у пациентов с топографически труднодоступной локализацией очага инфекции (нр. эндокардит), при некоторых внутрибольничных инфекциях, хронических инфекциях и у пациентов с иммунодефицитом.

Е-тест — уникальная запатентованная техника. Его принцип состоит в том, что на пластиковую тест-полоску нанесены последовательные разведения антибиотика от меньшего к большему и позволяет точно определить, по меньшей мере, по 15-ти разведениям антимикробную активность бактериальных агентов как прихотливых так и нет.

Процедура проведения теста проста, стрип с реагентом кладется на поверхность засеянного агара из стандартного разведения. После инкубации результат считывается по нанесенной на пластинку шкале разведений по месту пересечения зоны задержки роста, виде эллипса, с тест-полоской.

Е-тест имеет ряд преимуществ в контроле резистентности, т. к. он содержит градиент концентраций, способный показать малейшие изменения чувствительности. Ширина градиента концентраций этого теста покрывает вариации чувствительности микроорганизмов и определяет как низкий, так и высокий уровни резистентности.

Это наиболее чувствительный тест на сегодня. Е-тест — это макрометод, который может быть легко внедрен в лабораторию для определения чувствительности. В эру открытия все новых инфекций и возрастающей резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, Е-тест признан во всем мире как важнейшая инновация в определении антимикробной активности.

В каталоге Биомерье 2013 года на стр. 33 - 36 представлен вполный перечень Е-тестов (100 наименований):

Противобактериальные
Противогрибковые
Противотуберкулезные
На определение полирезистентности

	Наименование	Кат. №
	противогрибковый	20306
		19364
		20307
		20457
		21040
		21053
		21055
		19361
		19362
	Упаковка из фольги содержит картридж из пенного материала с 30 стрипами и влагопоглотитель; хранить 2-8°С или при контролируемой комн. t°С	19363
	упаковка представляет собой блистер (пластиковая секционная упаковка), состоящий из 10 ячеек, каждая из которых содержит по 3 стрипа (противобактериальные). Хранение при -20°С	19365
	Упаковка представляет собой блистер (пластиковая секционная упаковка), состоящий из 10 ячеек, каждая ячейка содержит по 3 стрипа (противобактериальные). Хранение при -20°С	19366
	Упаковка представляет собой блистер (пластиковая секционная упаковка), состоящий из 10 ячеек, каждая из которых содержит по 3 стрипа (противобактериальные). Хранение при -20°С	19359
	Упаковка из фольги содержит картридж из пенного материала с 30 стрипами и влагопоглотитель; хранить 2-8°С или при контролируемой комн. t°С	19371
	Упаковка из фольги содержит картридж из пенного материала с 30 стрипами и влагопоглотитель; хранить 2-8°С или при контролируемой комн. t°С	19375
	Упаковка из фольги содержит картридж из пенного материала с 30 стрипами и влагопоглотитель; хранить 2-8°С или при контролируемой комн. t°С	19374
	Упаковка из фольги содержит картридж из пенного материала с 30 стрипами и влагопоглотитель; хранить 2-8°С или при контролируемой комн. t°С	19373
	Упаковка представляет собой блистер (пластиковая секционная упаковка) из 10 ячеек, каждая ячейка содержит по 3 стрипа (противобактериальные). Хранение при -20°С	19372
	Упаковка представляет собой блистер (пластиковая секционная упаковка) из 10 ячеек, каждая ячейка содержит по 3 стрипа (противобактериальные). Хранение при -20°С	19370
	Упаковка из фольги содержит картридж из пенного материала с 30 стрипами и влагопоглотитель; хранение 2-8°С или при контролируемой комн. t°С	19360

Etest® представляет собой полоску из инертного пластика, на которую нанесен антимикробный препарат в концентрации, изменяющейся по градиенту от минимальной до максимальной, в диапазоне, эквивалентном 15 двукратным разведениям. С другой стороны на полоску нанесена шкала соответствующих минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Е-тесты позволяют определять минимальную ингибирующую концентрацию антимикробного препарата (количественный диффузионный метод).
. Засейте чашку культурой микроорганизма.
. Разместите полоски Etest® (до 2 на стандартную чашку диаметром 90 мм, или до 6 на чашку диаметром 180 мм).
. В процессе культивирования вокруг полоски сформируется эллипсовидная зона ингибирования роста, которая пересекает стрип в точке, соответствующей МИК.
. Е-тесты используются более 20 лет.
. Более 100 антимикробных препаратов.
. Стрипы для выявления полирезистентности.
. Определение чувствительности прихотливых микроорганизмов, стрептококков, анаэробных микроорганизмов, грибов (в т.ч. плесневых), микобактерий туберкулеза и пр.
. Удобная форма выпуска: по 30 или 100 штук, в блистерной упаковке или пенопластовом картридже.

	Номер по каталогу
	Индивидуальная упаковка	Пенопластовый картридж (t° хранения +20°С / +4°С)		(t° хранения -20°С)
Наименование	30 стрипов	100 стрипов	30 стрипов	100 стрипов	30 стрипов
Противогрибковые
E-тест Амфотерицин		526318	526310
E-тест Анидулафунгин				532008	532000
E-тест Вориконазол		532818	532810
E-тест Итраконазол	412380	525818	525810
E-тест Каспофунгин	412269	532418	532410
E-тест Кетоконазол		525918	525910
E-тест Микафунгин				535708	535700
E-тест Позаконазол			532118	532110
E-тест Флюконазол	412350	510818	510810
E-тест Флюцитозин		510918	510910
Противотуберкулезные
E-тест Изониазид					527900
E-тест Этамбутол					527700
E-тест Этионамид					527500
Противобактериальные
E-тест Азитромицин	412251	501618
E-тест Азтреонам	412259	501718	501710
E-тест Амикацин	412219	501318
E-тест Амоксициллин	412243	500918
E-тест Амоксициллин / клавулановая кислота (2/1)	412241	501018	501010
Е-тест Ампициллин	412253	501518
E-тест Ампициллин/сульбактам (2/1)	412251*	501818	501810
E-тест Бацитрацин				528608	528600
E-тест Бензилпенициллин (высокая концентрация)	412263	502518
E-тест Бензилпенициллин (низкая концентрация)	412265	502618
E-тест Ванкомицин	412488	525518
E-тест Гатифлоксацин		530218	530210
E-тест Гентамицин (высокая концентрация)				512708	512700
E-тест Гентамицин (низкая концентрация)	412368	512518
E-тест Даптомицин	412324	535018	535010
E-тест Доксициклин	412328***	509718	509710
E-тест Дорипенем	412326***	535918	535910
E-тест Имипенем	412374	513618
E-тест Канамицин		527818	527810
E-тест Кларитромицин		508718	508710
E-тест Клиндамицин	412315	509518
E-тест Колистин	412317**			537308	537300
E-тест Левофлоксацин	412393	527418
E-тест Линезолид	412396	531318
E-тест Меропенем	412402	513818
E-тест Метронидазол	412404	530018
E-тест Мециллинам				513708	513700
E-тест Миноциклин	412409***	516018	516010
E-тест Моксифлоксацин	412411**	529018	529010
E-тест Мупироцин	412417***	413496			516300
E-тест Налидиксовая кислота				516508	516500
E-тест Нетилмицин		517518	517510
E-тест Нитрофурантоин	412426***			530408	530400
E-тест Норфлоклацин	412428**			519508	519500
E-тест Оксациллин	412432	520518
E-тест Офлоксацин		519618	519610
E-тест Пиперациллин		521518	521510
E-тест Пиперациллин/тазобактам (4мкг/мл)	412434	521418
E-тест Полимиксин				533408	533400
E-тест Рифампицин	412450	526018	526010
E-тест Спектиномицин		529218	529210
E-тест Стрептомицин	412454			526808	526800
E-тест Сульфаметоксазол		534118	534110
E-тест Тейкопланин	412461	522018
E-тест Тетрациклин	412471	522518
E-тест Тайгециклин	412475	533518
E-тест Тикарциллин/клавулановая кислота		522618	522610
E-тест Тобрамицин (высокая концентрация)				533108	533100
E-тест Тобрамицин (низкая концентрация)		522718	522710
E-тест Триметоприм		523618	523610
E-тест Триметоприм/сульфаметоксазол (1/16)	412481	524418
E-тест Фосфомицин				529108	529100
E-тест Фузидиева кислота		511518	511510
E-тест Хинупристин/дальфопристин		528718	528710
E-тест Хлорамфеникол	412309	507518	507510
E-тест Цефаклор		504518	504510
E-тест Цефалотин	412307	503518	503510
E-тест Цефепим	412273	505018	505010
E-тест Цефиксим	412275	529918	529910
E-тест Цефокситин	412285	506518	506510
E-тест Цефоперазон/сульбактам (2/1)		529318	529310
E-тест Цефотаксим (высокая концентрация)	412279	505518
E-тест Цефотаксим (низкая концентрация)	412281	505618
E-тест Цефотетан				506308	506300
E-тест Цефпиром				506408	506400
E-тест Цефподоксим		505818	505810
E-тест Цефтазидим	412293	506718
E-тест Цефтаролин	412291
E-тест Цефтизоксим				527308	527300
E-тест Цефтобипрол	412297
E-тест Цефтриаксон (высокая концентрация)	412301	506618			506700
E-тест Цефтриаксон (низкая концентрация)	412303	507018			507000
E-тест Цефуроксим		506918	506910
E-тест Ципрофлоксацин	412311	508618
E-тест Энрофлоксацин				528908	528900
E-тест Эритромицин	412334	510518
E-тест Эртапенем	412332	531618	531610

	Номер по каталогу
	Индивидуальная упаковка	Пластиковая секционная упаковка (t° хранения -20°С)
Наименование	30 стрипов	100 стрипов	30 стрипов
Определение полирезистентности
E-тест Цефотаксим / Цефотаксим + клавулановая кислота (4 мкг/мл)	412336**	532208	532200
E-тест Цефтазидим / Цефтазидим + клавулановая кислота (4 мкг/мл) Предназначен для определения наличия ферментов бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), ингибируемых клавулановой кислотой, у грамотрицательных бактерий, в том числе Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, других представителей семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa	412340**	532508	532500
E-тест Цефепим / Цефепим + клавулановая кислота (4 мкг/мл) Предназначен для определения наличия ферментов бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), ингибируемых клавулановой кислотой, у грамотрицательных бактерий, в том числе Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, других представителей семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa	412338**	534708	534700
E-тест Имипенем / Имипенем + ЭДТА Предназначен для определения наличия ферментов металло-бета-лактамаз у грамотрицательных бактерий, в том числе Pseudomonas spp., Acinetobacter spp.		534208	534200
E-тест Ванкомицин / Тейкопланин Предназначен для определения устойчивости (или умеренной устойчивости) к гликопептидам грамположительных бактерий, в том числе Staphylococcus aureus, Enterococcus spp.		537208	537200
E-тест Цефотетан / Цефотетан + клаксациллин Предназначен для определения наличия ферментов AmpC-бета-лактамаз у грамотрицательных бактерий		537108	537100

Классификация, общие подходы к проведению. Диффузионные методы: метод бумажных дисков, Е-тест.

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы:
1. Диффузионные методы:
. с использованием дисков с антибиотиками
. с помощью Е-тестов
2. Методы серийных разведений:
. разведение в жидкой питательной среде (бульоне)
. разведение в агаризованной среде
Методы определения чувствительности были разработаны во второй половине 60-х - начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.
Для всех методов общими являются следующие этапы:
- приготовление и проверка качества питательных сред
- приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)
- инокуляция
- для дифузионных методов - этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.
- инкубирование
- учет и интерпретация результатов
- формулировка рекомендаций по Лечению
Диффузионные методы основаны на диффузии антибактериального препарата (АБП) из носителя в плотную питательную среду, инокулированную микроорганизмом, и регистрации диаметра зоны ингибирования (задержки) роста исследуемого микроорганизма.
. Метод менее чувствителен и менее точен, чем метод серийных разведений, но на практике применяется чаще из-за своей простоты. Размещено на реф.рф.
. Скорость диффузии в агар любого препарата зависит от его структуры, молекулярной массы, наличия примесей, состава и рН среды.
Метод бумажных дисков с антибиотиком (дискодиффузионный метод).
. Для проведения этого метода используют стандартные диски, содержащие определенное количество антибиотиков, и стандартную питательную среду, необходимую для роста данного вида микроорганизма. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. . На поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности. . Помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. . Инкубируют при уcловиях, благоприятных для каждого конкретного микроорганизма. . Измеряют диаметры зон задержки роста вокруг диска в миллиметрах (с учетом диаметра диска). . Оценивают результат по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. . Исследуемую культуру относят к одной из трех категорий: чувствительная, умеренно- чувствительная и устойчивая

Е-тест (E-test или эпсилометрический метод)
Метод близок по технологии постановки к методу бумажных дисков.
. В качестве носителя используется узкая полоска полимера (0.5х6.0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Значения концентрации АБП в каждом участке полоски нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности.
. Ингибирование роста микроорганизма вокруг полоски носителя происходит в зоне, где концентрация антибиотика, диффундирующего из носителя, выше МПК.
. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е- теста получают значение МПК.
Е-тест сочетает простоту постановки метода бумажных дисков и точность метода серийных разведений

Методы, используемые для сравнительной оценки in vitro лекарственных средств антимикробной терапии: метод серийных разведений в жидкой и плотной питательных средах.

Методы серийных разведений:
. Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроорганизма к антибактериальным средствам и определить МПК препарата.
. Используют для сравнительной оценки антимикробной активности in vitro разрабатываемого препарата-генерика и оригинального средства.
. Для определения величины МПК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.
. Основаны на использовании двукратных последовательных разведений концентраций АБП от максимальной к минимальной (например, от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл).
. Проводятся в жидкой и агаризованной питательных средах. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде (бульоне)
Существует 2 варианта данного метода:
макрометод (пробирочный) и микрометод (планшетный).
Макрометод.
. Тестирование проводят в пробирках в конечном объеме 1 мл для каждого разведения.
. Питательный бульон разливают по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок определяют необходимым диапазоном разведений АБП.
. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов:
- Из стандартной суспензии каждого исследуемого микроорганизма (~ 10 8 КОЕ/мл) готовят рабочую суспензию (~ 10 6 КОЕ/мл) . Приготовление двукратных серийных разведений АБП: - готовят основной раствор АБП исследуемого препарата-генерика и препарата сравнения (оригинального) в концентрации 1000 мкг/мл и выше (с учетом содержания содержания активного вещества). -из основных растворов АБП исследуемого препарата-генерика и препарата сравнения (оригинального) готовят рабочие растворы АБП с использованием жидкой питательной среды. (Концентрация рабочих растворов рассчитывается исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений с учетом фактора разбавления при последующей инокуляции суспензией микроорганизма) ‐ готовят серийные разведения: 0,5 мл рабочего раствора АБП вносят в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Перемешивают. Новой пипеткой (наконечником) переносят 0,5 мл раствора АБП в бульоне во вторую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона и т.д., пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл удаляют. Т.о., получают ряд пробирок с растворами АБП, концентрации в которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза. Инокуляция: по 0,5 мл микробной суспензии с концентрацией микроорганизма ~ 10 6 вносят в каждую пробирку с 0,5 мл соответствующего разведения АБП. Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке ~ 5х10 5 КОЕ/мл. . Контроль - пробирка с бульоном и культурой микроорганизма (контроль роста). Отрицательный контроль - пробирка с бульоном (контроль стерильности). . Инкубирование: все пробирки, закрытые пробками, или колпачками, инкубируют при условиях, обеспечивающих рост испытуемых микроорганизмов. . Учет и интерпретация результатов: пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в пробирке с АБП сравнивают с контрольной пробиркой. - наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. ‐ по мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). лекарственных средств антибактериальной терапии - сравнивают результаты, полученные для оригинального ЛС и исследуемого генерического ЛС. Делают вывод об их эквивалентности в отношении спектра (перечень используемых микрорганизмов) и степени антимикробной активности (значения МПК).

. Определение МБК: из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МПК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста. . Недостаток метода: низкая производительность - применение ограничивается исследованиями небольшого числа микроорганизмов.
Микрометод
.Процедура проведения испытания аналогична таковой при использовании макрометода
.Величина конечного объема - до 0,2 мл.Наличие соответствующего оснащения лаборатории: планшет на 96 лунок со стерильными крышками, многоканальных пипеток.Рабочие растворы АБП можно вносить в лунки планшет заранее, после чего хранить запаянными в полиэтилене при температуре ниже 60°С до момента использования. . Преимущества метода: - высокая производительность - возможность длительного хранения заранее приготовленных планшет - экономия расходных материалов. Размещено на реф.рф
Метод серийных разведений в агаризованной среде. Принцип проведения испытания аналогичен методу разведений в бульоне. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов: - стандартная суспензия каждого исследуемого микроорганизма должна содержать ~ 10 8 КОЕ/мл. - стандартную микробную суспензию для проведения эксперимента разводят ~ в 10 раз до получения концентрации микроорганизма ~ 10 7 КОЕ/мл. Приготовление двукратных серийных разведений АБП для оригинального препарата и исследуемого препарата- генерика проводят аналогично методу разведений в бульоне. Агаризованную среду расплавляют и охлаждают до температуры 45-50°С. . Приготовление чашек с агаризованной средой и разведениями АБП: смешивают агаризованную среду и растворы АБП непосредственно в чашке Петри (для пластиковых чашек диаметром 90 мм к 2 мл раствора АБП добавляют 18 мл расплавленного и охлажденного агара). . Инокуляция и инкубирование: бактериологической петлей переносят 1-2 мкл суспензии исследуемых микроорганизмов на поверхность агаризованной среды. Таким образом, конечная посевная доза составляет ~ 10 4 КОЕ (стандартная бактериологическая петля диаметром 3 мм переносит 1-2 мкл жидкости). . На поверхности агара образуется пятно диаметром 5-8 мм. После подсыхания чашки переворачивают и инкубируют при условиях, благоприятных для роста исследуемых микроорганизмов. . Учет и интерпретация результатов: аналогично методу разведения в бульоне. Чашки Петри помещают на темную, не отражающую свет поверхность. За МПК принимают концентрацию АБП, вызвавшую полное ингибирование видимого роста. . Контроль: инокулированные суспензией культур микроорганизмов чашки с агаром без АБП (контроль роста). Отрицательный контроль: чашки с агаром (контроль стерильности). Преимущества метода: на одной чашке можно определять чувствительность нескольких микроорганизмов.

Объем исследований по сравнительной оценке in vitro антимикробной активности для генерических и оригинальных средств антимикробной терапии.

Объем исследований по сравнительной оценке in vitro антимикробной активности генерических противомикробных лекарственных средств:
.Задача исследования: подтверждение соответствия генерического препарата референсному (оригинальному) по спектру (микроорганизмы) и степени (значение МПК, МБК) антимикробной активности.
.Набор тестируемых микроорганизмов: по 1-2 штамма каждого из входящих в спектр действия микроорганизмов
- эталонные коллекционные штаммы
-выделенные в стационарах клинические штаммы
.Определяются значения МПК и МБК
.Контроль: препарат сравнения - оригинальный препарат
.Ожидаемый результат: МПК и МБК разрабатываемых генерических противомикробных ЛС входят в допустимые диапазоны значений и полностью совпадают с МПК и МБК препаратов сравнения (оригинальных ЛС) в отношении коллекционных и клинических штаммов.
Порядок исследований по определению in vitro антимикробной активности новых противомикробных соединений:
.Первичная оценка чувствительности к новым соединениям эталонных штаммов различных видов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов (4-5 штаммов для каждого вида);
.Детальное изучение степени антибактериальной активности соединений в отношении штаммов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов из международных коллекций с известными механизмами резистентности (метод серийных разведений);
.Исследование активности в отношении клинических штаммов условно патогенных и патогенных микроорганизмов в сравнении с известными препаратами близкой химической группы или аналогичными по антимикробному эффекту:
- в случае преимущественной активности в отношении грамположительных микроорганизмов контроль - природные пенициллины, цефалоспорины I - II поколений, макролиды, линкозамиды; - при активности в отношении грамотрицательных микроорганизмов контроль - полимиксин В, азтреонам; -для препаратов широкого спектра действия контроль - полусинтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины, цефалоспорины III - IV поколений
. Оценка антимикробной активности в отношении проблемных возбудителей: метициллинорезистентные стафилококки, устойчивые к бензилпенициллину Streptococcus pneumonia, множественноустойчивые энтеробактерии, устойчивые к аминогликозидам бактерии рода Pseudomonas и др.
.Первоначальные терапевтические концентрации новых препаратов устанавливаются с учетом токсичности, определенной в опытах по изучению острой токсичности;
. Сравнительную степень антибактериальной активности препаратов оценивают величиной МПК или МБК, определяемых не менее, чем при 2-х значениях посевной дозы: минимальной - 10 4 - 10 5 КОЕ/мл и максимальной - 10 6 - 10 9 КОЕ/мл в зависимости от вида возбудителя; На сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.

Лекция, реферат. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам - понятие и виды. Классификация, сущность и особенности.

Оглавление книги открыть закрыть

1. Фармацевтическая микробиология. Предмет и задачи фармацевтической микробиологии.
2. Фармация и фармацевтика: история возникновения и развития.
3. Лекарственное средство: определение, классификация.
4. Состав лекарственных средств | фармацевтическая субстанция, вспомогательное вещество.
5. Оригинальные и генерические лекарственные средства. Наименование лекарственных средств.

10. Действие повреждающих факторов на микроорганизмы. Влияние температурного фактора и его использование в фармацевтике.
11. Действие излучения на микроорганизмы, типы излучения.
12. Влияние на микроорганизмы химических повреждающих факторов
13. Стерилизация. Уровень гарантии стерильности (SAL). Критерии выбора метода стерилизации.
14. Термическая и химическая стерилизация
15. Контроль эффективности работы стерилизующих устройств.
16. Промышленная дезинфекция
17. Дезинфектанты и антисептики. Требования, предъявляемые к химическим дезинфектантам и антисептикам.
18. Консерванты и их использование в фармацевтическом производстве

Диско-диффузионный метод

На поверхность плотной питательной среды, засеянной сплошным газоном исследуемой культурой, накладывают не более 6 дисков, пропитанных антибиотиками, на расстоянии не менее 2 см друг от друга. Регистрация результатов проводится через 18-24 часов инкубирования в термостате по диаметру зоны отсутствия роста вокруг дисков с антибиотиками. Наличие роста вокруг диска свидетельствует о нечувствительности данного микроба к антибиотику. Для интерпретации результатов используются специальные таблицы.

Рисунок 1. Определение чувствительности

микроорганизмов диско-диффузионным методом:

1 – микроорганизм чувствителен к антибиотику;

2 – микроорганизм умеренно резистентен к антибиотику;

3 – микроорганизм устойчив к антибиотику.

Метод Е-тестов

Принцип метода. Определение чувствительности микроорганизма проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов

Метод серийных разведений в бульонной среде

В пробирках, содержащих 1 мл Мюллер-Хинтон бульона, готовят серийные двукратные разведения антибактериального препарата, например 100 мкг/мл – 1-я, 50 мкг/мл – 2-я, 25 мкг/мл – 3-я, 12,5 мкг/мл – 4-я и т.д. Затем в каждую пробирку вносят 0,1 мл испытуемой бактериальной суспензии. Одновременно ставят контроль роста (1 мл Мюллер-Хинтон бульона и 0,1 мл суспензии бактерий). Посевы инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч., после чего отмечают результаты. Отсутствие помутнения среды свидетельствует о задержке роста бактерий в присутствии данной концентрации препарата.

Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) – наименьшая концентрация антибиотика (в мкг/мл или мг/л), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий.

2 Определение чувствительности разных штаммов стафилококков к антибиотикам методом стандартных дисков

Антибиотик	Зона подавления роста, мм	Характеристика штамма

Исследуемая культура является чувствительной к __________________________________________________

умеренно устойчивой к _________________________________________________________________________,

устойчивой к _________________________________________________________________________________.

3 Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) пенициллина методом серийных разведений.

Вывод: МПК пенициллина для исследуемого штамма составляет _____________________________________

Достоинства метода:____________________________________________________________________________

Недостатки метода:____________________________________________________________________________

4 Выявление и регистрация антагонистического действия разных видов бактерий.

На чашку с МПА штрихом по диаметру засевается микроб-антагонист и перпендикулярно к нему тест-штаммы. Учет результатов проводится через сутки после посева. Наличие и степень антагонистического действия определяют по величине зон задержки роста тест-культур.

Штриховой посев________________________

Вывод: наибольшее антагонистическое действие выявлено к тест-штаммам (укажите виды) _____________________________________________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ № 8

ТЕМА: ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ ПО ТЕМЕ: «ИСТОРИЧЕСКИЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ МИКРОБИОЛОГИИ, МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ».

Формы и размеры истинных бактерий. Характеристика шарообразных, палочковидных и извитых форм истинных бактерий.

Структура бактерий. Основные отличия прокариотной клетки от эукариот.

Клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Типы микроскопических препаратов. Техника приготовления фиксированных препаратов.

Техника микроскопии в световом микроскопе. Изучение морфологии микроорганизмов в электронном микроскопе.

Тинкториальные свойства микробов. Красители. Простые способы окраски фиксированных препаратов.

Принципы классификации патогенных прокариот (Берджи, 2001).

Защитные приспособления у микроорганизмов. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое значение.

Капсулы бактерий, их значение.

Жгутики, их строение. Реснички. Секс-пили.

Сложные способы окраски. Техника окраски по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру.

Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии. КОН-тест. Принцип метода.

Спирохеты. Систематическое положение и морфология спирохет. Особенности ультраструктуры и химического состава. Методы исследования.

Актиномицеты, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды. Роль актиномицетов в природе и медицине. Методы выявления.

Таксономия хламидий. Морфология, структура, способы выявления. Цикл развития хламидий.

Риккетсии, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды.

Микоплазмы. Классификация. Филогенез. Способы выявления.

Дефектные формы микробов: протопласты, сферопласты, L-формы.

Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам питания Аутотрофы и хемоорганотрофы

Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.

Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.

Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез). Источники и пути получения энергии у хемоорганотрофов.

Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.

Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.

Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм. Размножение бактериальных популяций.

Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов.

Питательные среды для культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.

Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.

Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Свойства микроорганизмов, используемые для идентификации выделенных культур.

Ферменты бактерий, классификация. Способы изучения биохимических свойств микроорганизмов. Практическое использование биохимической активности в идентификации бактерий

Определение сахаролитических свойств, состав сред Гисса; определение протеолитических свойств, определение каталазной и оксидазной активности.

Принцип работы и особенности применения приборов автоматической идентификации бактериальных культур (гемокультиватор, автоматический анализатор).

Особенности культивирования риккетсий и хламидий.

Бактериофаги (фаги). История открытия. Морфология, структурные особенности, химический состав и свойства фагов.

Вирулентные фаги. Фазы взаимодействия с бактериальной клеткой. Результаты взаимодействия фага и клетки. Умеренные фаги. Профаг. Явление лизогении. Фаговая конверсия.

Методы выделения и титрования бактериофагов на плотных и жидких питательных средах.Применение фагов в микробиологии и медицине. Фагодиагностика и фаготипирование.

Наследственность. Организация генетического аппарата у бактерий (нуклеоид, плазмиды, Is -последовательности, транспозоны).

Принципы функционирования бактериального генома. Организация оперона. Генотип и фенотип.

Плазмиды, классификация, структура и свойства плазмид. R-плазмида, особенности структуры и функции. Плазмиды бактериоциногении.

Изменчивость микробов. Модификации у бактерий, значение, основные проявления и свойства (ненаследственный характер, адаптивность, высокая частота прямых и обратных изменений, множество индуцирующих факторов).

Генотипическая изменчивость. Мутации и их классификация. Мутагены. Фенотипические проявления мутаций. Судьба мутантов. Диссоциация у бактерий. Влияние отбора. Система репарации повреждений генома.

Рекомбинационная изменчивость. Механизмы образования комбинированных геномов. Частота изменений отдельных признаков. Трансформация, трансдукция, конъюгация.

Практическое значение знаний о генетике микробов. Принципы генетического картирования.

Методы генетического анализа (молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция, блотинг, секвенирование).

Понятие о генной инженерии и использование ее методов в микробиологии и биотехнологии. Получение и применение генно-инженерных вакцин и цитокинов.

Противомикробные мероприятия. Влияние экологических факторов на микробы. Действие физических факторов (температуры, высушивания, излучений, ультразвука, осмотического давления). Действие химических факторов.

Цели, способы, средства и объекты стерилизации и дезинфекции в медицинской и микробиологической практике. Контроль качества дезинфекции. Контроль стерилизации и стерильности. Способы проведения.

Антисептика. Определение. Антисептические средства, требования, происхождение, свойства, группы, механизмы действия на микробы. Типы антисептики. Терапевтическая антисептика. Профилактическая антисептика.

Химиотерапевтические препараты. Свойства. Основные группы химиопрепаратов. Механизмы действия на бактерии. Понятие об избирательности и "мишенях" действия.

Антибиотики. Определение. Продуценты антибиотиков. Синтетические и полусинтетические антибиотики.

Основные группы антибиотиков по химической структуре. Бета-лактамные антибиотики Тетрациклины. Аминогликозиды. Макролиды и азолиды. Анзамицины (рифампицины). Левомицетин. Фторхинолоновые антибиотики. Линкомицин. Полимиксины. Гликопептиды

Классификация антибиотиков про механизму действия на бактериальную клетку.

Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам и другим химиопрепаратам. Техника постановки, учета и оценки чувствительности методом дисков, Е-теста, серийных разведений.

ЗАНЯТИЕ № 9

ТЕМА: ЭКОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ. ИНФЕКЦИЯ. ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ. ТОКСИНЫ МИКРОБОВ. БИОЛОГИЧЕСКИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ) МЕТОД.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

Микрофлора тела человека. Нормальная (резидентная) микрофлора человека. Аутохтонная и аллохтонная, пристеночная и просветная микрофлора. Формирование и развитие нормальной микрофлоры. Функции нормальной микрофлоры: противоинфекционная, метаболическая, иммунобиологическая, антитоксическая.

Дисмикробиоценоз (дисбактериоз), причины, виды, принципы коррекции.

Понятие об инфекции. Определение, общая характеристика. Отличия инфекционных болезней от неинфекционных.

Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Инфицирующая доза. Способы заражения. Входные ворота. Патогенность и вирулентность. Генетический контроль патогенности и вирулентности. Факторы, повышающие и снижающие вирулентность микробов.

Факторы патогенности. Методы определения вирулентности, единицы. Облигатно-патогенные и условно-патогенные микроорганизмы.

Токсичность и токсигенность микроорганизмов. Эндотоксины, свойства, получение, применение. Экзотоксины, свойства, получение, единицы измерения. Типы экзотоксинов, механизм действия.

Роль макроорганизма в развитии и течении инфекционных болезней. Наследственные факторы. Анатомо-физиологическое состояние организма. Роль условий жизни в развитии и течении инфекционных болезней. Природные факторы. Социальные факторы.

Классификация инфекционных процессов по тяжести, характеру возбудителя, по источнику инфекции, способу передачи возбудителя и механизму заражения, по распространенности. Классификация инфекционных процессов по локализации микробного очага, длительности течения и кратности заражения.

Динамика инфекционного процесса, его особенности.

Биологический (экспериментальный) метод исследования, этапы, оценка. Лабораторные животные. Способы заражения.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1 Изучения нормальной микрофлоры.

А) Посев для изучения нормальной микрофлоры кожи рук на среду Эндо и кровяной агар методом реплик .

Принцип метода: стерильные кусочки фильтровальной бумаги 1х1 см в чашке Петри увлажнить стерильным физ. раствором. Стерильным пинцетом поместить кусочек бумаги на исследуемую поверхность кожи рук на 0,5 мин. Поместить бумагу на поверхность плотной питательной среды (отпечаток) на 1 мин. Бумагу удалить. Чашки с отпечатками инкубировать при 37 0 С, 24-48 часов.

В) Провести учет посева микрофлоры, приготовить препараты из разных типов колоний, окрасить по Граму, микроскопировать (в демонстрационных посевах).

Учет посева микрофлоры:

Микроскопия препаратов:

Препарат______________

_______________________

Окраска _______________

_______________________

Препарат______________

_______________________

Окраска _______________

_______________________

2 Оценка адгезивности E . coli по их способности к адсорбции на поверхности эритроцитов

Принцип метода: К суспензии эритроцитов добавляют испытуемую культуру микроорганизмов. После инкубации готовят мазки, окрашивают и под микроскопом определяют среднее количество бактерий, адсорбировавшихся на одном эритроците.

Эритроциты в данном случае используются в качестве модели клетки восприимчивого микроорганизма.

3 Определение ферментов инвазивности у стафилококков

1. Плазмокоагулаза

Принцип метода: В пробирку, содержащую цитратную плазму крови кролика, вносится испытуемая культура. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате плазма свертывается (коагулирует).

2. Фибринолизин

Принцип метода: В пробирку с фибрином (отмытый от эритроцитов сгусток крови) вносят испытуемую культуру. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате сгусток растворяется.

3. Гиалуронидаза

Принцип метода: В пробирку с гиалуроновой кислотой (ГУК) вносят испытуемую культуру. После инкубации в термостате добавляют реактив, вызывающий свертывание ГУК и учитывают результат. При положительном результате (вследствие расщепления ГУК) сгустка не образуется.

4. Лецитовителлаза (лецитиназа)

Принцип метода: выделенные культуры стафилококка засевают на желточно-солевой агар, который содержит 7,5% хлорида натрия и желточную суспензию. При положительном результате вокруг колоний вирулентных стафилококков образуется радужный ореол вследствие расщепления лецитина, содержащегося в желтке куриного яйца.

Вывод: (перечислите ферменты вирулентности каждого из двух изученных штаммов) _____________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

Бактериальные токсины

Токсичность __________________________________________________________________________________

Токсигенность _________________________________________________________________________________

Эндотоксин ___________________________________________________________________________________

Эндотоксический шок ___________________________________________________________________________

Практическое применение эндотоксинов:

Экзотоксин ___________________________________________________________________________________

Анатоксин ____________________________________________________________________________________

Схема получения экзотоксина и анатоксина.

1.____________________________________________________________________________________________

2.____________________________________________________________________________________________

4.____________________________________________________________________________________________

Практическое применение анатоксинов: